新型的空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)工具將傳統(tǒng)成像與分子分析融為一體，讓您更全面地了解感興趣的生物學(xué)特征。無(wú)論您是揭示神經(jīng)系統(tǒng)復(fù)雜性的神經(jīng)科學(xué)家，還是深入解析腫瘤微環(huán)境的轉(zhuǎn)化研究人員，抑或是嘗試回答各種其他問(wèn)題的科學(xué)家，空間維度的見(jiàn)解都能為您的研究項(xiàng)目打開(kāi)新的大門。
互補(bǔ)的空間工具：
Visium HD和Xenium原位分析
Visium HD是一種基于測(cè)序的空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析，它采用基于探針的化學(xué)方法進(jìn)行空間背景下的全轉(zhuǎn)錄組分析。將探針與靶點(diǎn)雜交，再與標(biāo)準(zhǔn)載玻片上的組織相連接。洗掉未結(jié)合的探針，然后通過(guò)CytAssist將結(jié)合的探針精確轉(zhuǎn)移到Visium HD玻片上（這個(gè)關(guān)鍵步驟可通過(guò)最大限度減少擴(kuò)散來(lái)提高空間保真度）。然后利用這些探針生成帶有空間條形碼的NGS文庫(kù)，以便生成測(cè)序讀數(shù)。
Xenium是一種基于成像的空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析，使用了靶向預(yù)選基因的鎖式探針。與目標(biāo)基因雜交后，探針通過(guò)連接而環(huán)化（為靶點(diǎn)特異性增添了一層可信度），并在滾環(huán)反應(yīng)中擴(kuò)增。之后在Xenium分析儀上，通過(guò)多輪熒光探針雜交、組織成像和探針去除對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，產(chǎn)生基于成像的讀數(shù)。
Ayako Suzuki博士正是這么做的。根據(jù)她最近發(fā)表在《Nature Communications》上的文獻(xiàn)（5），她首先使用Visium v2來(lái)確定肺部腫瘤中的基因表達(dá)變化發(fā)生在哪些位置，然后用Xenium來(lái)放大，精確定位與腫瘤亞型中的肺泡塌陷相關(guān)的特定細(xì)胞和細(xì)胞類型。
關(guān)于多重分析：
全轉(zhuǎn)錄組、靶向分析和定制選項(xiàng)
多重分析：?jiǎn)未畏治隹蓽y(cè)定多少種RNA（基因、外源基因、同源異構(gòu)體等）。
每個(gè)平臺(tái)達(dá)到的轉(zhuǎn)錄本覆蓋廣度和深度各不相同。為了提供廣泛的覆蓋，Visium HD能夠無(wú)偏地覆蓋整個(gè)轉(zhuǎn)錄組（約20,000個(gè)基因）。再結(jié)合為其他感興趣的靶點(diǎn)設(shè)計(jì)定制探針的能力，Visium HD具有無(wú)以倫比的空間發(fā)現(xiàn)能力，能夠表征廣泛的組織，從頭鑒定感興趣的區(qū)域或細(xì)胞類型。
同時(shí)，Xenium通過(guò)多達(dá)480個(gè)基因的基因組合帶來(lái)了靶向分析功能（2024年即將推出的Xenium 5K人類和小鼠基因組合將擴(kuò)展到5,000個(gè)基因）。這些預(yù)設(shè)計(jì)的基因組合有多種配置，帶有組織或應(yīng)用特異性的靶點(diǎn)，最多可定制添加100個(gè)目標(biāo)基因。
表征靈敏度：
單基因靈敏度、基因檢測(cè)范圍和轉(zhuǎn)錄本豐度
靈敏度：定義檢測(cè)轉(zhuǎn)錄本的效果如何。盡管在空間技術(shù)領(lǐng)域被廣泛使用，但可以細(xì)分為：單基因靈敏度、基因檢測(cè)范圍和轉(zhuǎn)錄本豐度。使用哪個(gè)術(shù)語(yǔ)取決于作者想要強(qiáng)調(diào)哪個(gè)具體方面的性能。
分析能夠檢測(cè)到的每個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄本數(shù)量。這個(gè)指標(biāo)在分析差異基因表達(dá)和檢測(cè)稀有轉(zhuǎn)錄本、同源異構(gòu)體和基因變異等應(yīng)用中至關(guān)重要。再結(jié)合基因檢測(cè)范圍，這個(gè)指標(biāo)有助于確定分析的動(dòng)態(tài)范圍。
您能夠在每個(gè)細(xì)胞或組織區(qū)域內(nèi)檢測(cè)到多少種不同的轉(zhuǎn)錄本，具體取決于單基因靈敏度、多重分析和組織類型。在以發(fā)現(xiàn)為重點(diǎn)的應(yīng)用中，基因檢測(cè)范圍特別重要，例如表征健康或疾病狀態(tài)下的感興趣組織。
每個(gè)細(xì)胞或組織區(qū)域內(nèi)可檢測(cè)到的轉(zhuǎn)錄本總數(shù)。這個(gè)指標(biāo)可用來(lái)確定整體基因表達(dá)的大范圍變化。根據(jù)分析方法的單基因靈敏度、基因檢測(cè)范圍、多重分析以及分析的組織總面積計(jì)算得出。
那么Xenium和Visium的靈敏度相比之下如何呢？盡管Xenium和Visium HD的直接比較數(shù)據(jù)正在生成當(dāng)中，但我們最近在《Nature Communications》雜志上發(fā)表了一篇論文，對(duì)Xenium和“標(biāo)準(zhǔn)清晰度的”Visium v2在連續(xù)組織切片上的靈敏度進(jìn)行了比較。
在這個(gè)特定實(shí)驗(yàn)和樣本中，Xenium的單基因靈敏度高于Visium v2，而Visium v2的基因檢測(cè)范圍和轉(zhuǎn)錄本豐度均高于Xenium。這在很大程度上是由于Visium捕獲了整個(gè)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，而Xenium則采用了更加靶向的方法。此外，我們還注意到，在某些組織類型（但不是全部）中，以高于我們推薦的深度進(jìn)行測(cè)序會(huì)導(dǎo)致單基因靈敏度顯著升高。因此，在某些組織或樣本中，轉(zhuǎn)錄本豐度和單基因靈敏度會(huì)隨著測(cè)序深度而有所調(diào)整。
選擇分辨率：
如何分配轉(zhuǎn)錄本以及如何精細(xì)地分配？
分辨率：包括將轉(zhuǎn)錄本分配到定義的組織區(qū)域或細(xì)胞中的哪個(gè)位置，以及觀察它們的最精細(xì)程度。
Visium HD中的轉(zhuǎn)錄本被分配到一個(gè)小到足以捕獲單細(xì)胞的區(qū)域。具體來(lái)說(shuō)，利用CytAssist儀器將結(jié)合的探針精確轉(zhuǎn)移至捕獲區(qū)域，其中寡核苷酸連續(xù)排列在數(shù)百萬(wàn)個(gè)2 x 2 μm條形碼標(biāo)記的正方形中。然后以2 x 2 μm正方形單位以及多個(gè)合并單位輸出這種基于空間條形碼的測(cè)序讀數(shù)（包括8 x 8 μm合并單位，這是我們推薦的分析起點(diǎn)）（圖1A）。
由于這些正方形單位小到足以捕獲單細(xì)胞，這種方法能表征每個(gè)單位中存在的主要細(xì)胞類型。考慮到這種合并策略和真核細(xì)胞的平均大小（介于10到100 μm），每個(gè)合并區(qū)域可能覆蓋不止一個(gè)細(xì)胞的組分；因此，Visium HD帶來(lái)了我們所說(shuō)的單細(xì)胞分辨率（圖1B）。第三方工具可幫助您對(duì)Visium HD數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)據(jù)點(diǎn)解卷積。
圖1A. Visium HD的捕獲區(qū)域結(jié)構(gòu)。這張示意圖展示了Visium HD玻片的布局，帶有兩個(gè)6.5 x 6.5 mm的Visium HD捕獲區(qū)域，其中捕獲寡核苷酸連續(xù)排列在細(xì)分為2 x 2 μm的正方形單位內(nèi)。
圖1B. 對(duì)H&E染色后的人類結(jié)腸癌組織的Visium HD分析，轉(zhuǎn)錄本被分配到8 x 8 μm的合并單位內(nèi)。圖中展示了帶有無(wú)監(jiān)督基因表達(dá)聚類的人類結(jié)腸癌縮小圖像（左圖），以及8 x 8 μm單位內(nèi)的基因表達(dá)聚類放大圖像（右上圖）和H&E染色組織放大圖像（右下圖）。Visium HD能夠分辨2 x 2 μm正方形內(nèi)的轉(zhuǎn)錄本，但我們建議以8 x 8 μm的合并單位作為起點(diǎn)進(jìn)行可視化和分析。
Xenium原位分析將轉(zhuǎn)錄本分配到單個(gè)細(xì)胞中（圖2）。在Xenium運(yùn)行過(guò)程中，組織中的每條轉(zhuǎn)錄本會(huì)被分配X-Y-Z軸坐標(biāo)。之后，在儀器運(yùn)行過(guò)程中進(jìn)行多模態(tài)細(xì)胞分割，利用各種形態(tài)學(xué)染料和專門的人工智能算法來(lái)確定各個(gè)細(xì)胞的邊界。根據(jù)這些邊界及其空間坐標(biāo)將每條轉(zhuǎn)錄本分配給單個(gè)細(xì)胞，精度達(dá)到納米級(jí)（XY軸定位精度 < 30 nm，Z軸定位精度 < 100 nm）。
圖2. 利用Xenium Explorer對(duì)人類肺腺癌進(jìn)行分析。上圖顯示的是人類肺腺癌切片的圖像，下圖顯示了Xenium Explorer放大后的圖像，圖中展示了分割的細(xì)胞以及定位在單個(gè)細(xì)胞內(nèi)的與免疫細(xì)胞類型相關(guān)的選定轉(zhuǎn)錄本。
超越基因表達(dá)：
利用多組學(xué)功能獲取更多信息
多組學(xué)分析：除了RNA之外，您可以測(cè)定的全套分析物，比如形態(tài)、蛋白質(zhì)等。
Visium HD和Xenium都能評(píng)估同一張切片的形態(tài)（H&E染色）、蛋白質(zhì)（免疫熒光IF染色）和RNA數(shù)據(jù)。在撰寫(xiě)本文時(shí)，Visium HD可在單張切片上進(jìn)行H&E或IF染色，而Xenium可進(jìn)行兩種染色。
對(duì)于Visium HD分析，H&E或IF染色是在工作流程開(kāi)始前進(jìn)行的，這讓您能夠在Visium流程之前利用成像數(shù)據(jù)篩選組織切片。
對(duì)于Xenium，H&E和IF染色在Xenium工作流程結(jié)束后進(jìn)行。客戶還可以利用Xenium化學(xué)方法的非破壞性特點(diǎn)，在Xenium流程結(jié)束后對(duì)同一張切片進(jìn)行Visium分析（我們正在定量Xenium分析對(duì)Visium HD的分析性能有何影響，如果有的話）。最后，我們預(yù)計(jì)在2024年晚些時(shí)候推出適用于Xenium平臺(tái)的< 30重集成蛋白質(zhì)組學(xué)解決方案。
從理論思考到實(shí)際問(wèn)題：
組織類型、樣本形式和經(jīng)費(fèi)考量等
在試圖將新技術(shù)整合到您的實(shí)驗(yàn)室中時(shí)，實(shí)用性是關(guān)鍵的因素。在這一部分，我們將分析一些重要的考慮因素，如組織類型、樣本形式、數(shù)據(jù)分析方法和儀器使用。
組織是整個(gè)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)，而兩個(gè)因素將決定分析的進(jìn)程——組織是否固定以及它來(lái)源于哪個(gè)物種。
Xenium和Visium HD分析都與福爾馬林固定石蠟包埋（FFPE）組織兼容，而Xenium還與新鮮冷凍組織兼容。我們計(jì)劃在近期發(fā)布一套利用Visium HD分析新鮮冷凍組織的示范方案。
在物種兼容性方面，Visium HD可以對(duì)人類和小鼠進(jìn)行全轉(zhuǎn)錄組分析。如果您有意向分析非人類靈長(zhǎng)動(dòng)物或大鼠組織，請(qǐng)發(fā)郵件至support@10xgenomics.com，我們也許能提供您的物種與人類和小鼠探針組的同源性報(bào)告。對(duì)于Xenium分析，我們提供了人類和小鼠的預(yù)設(shè)計(jì)且可定制的基因組合。此外，Xenium分析也兼容其他物種，您可以通過(guò)高級(jí)定制設(shè)計(jì)流程（6）來(lái)創(chuàng)建基因組合，分析帶有轉(zhuǎn)錄組注釋的任何物種。
組織形式也是一個(gè)重要的考慮因素。Visium CytAssist儀器允許您使用存檔或預(yù)先切片的載玻片，以及從FFPE組織塊中專門新鮮制備的載玻片。Xenium則要求在Xenium載玻片上直接進(jìn)行組織切片。
如果您的組織是FFPE組織，來(lái)源于人類或小鼠，那么與任一平臺(tái)兼容。Xenium分析也與新鮮冷凍組織兼容，在即將發(fā)布的示范方案中，這一功能將擴(kuò)展到Visium HD。如果您研究的物種既非人類又非小鼠，Xenium可通過(guò)高級(jí)定制設(shè)計(jì)選項(xiàng)與任何物種兼容，而Visium HD可能與非人類靈長(zhǎng)動(dòng)物或大鼠兼容（取決于客戶支持指南）。
對(duì)于任何技術(shù)而言，樣本越多，耗時(shí)越長(zhǎng)。然而，這一普遍規(guī)律有兩個(gè)主要差別。首先，額外花費(fèi)的時(shí)間并不一定因每個(gè)額外樣本呈線性增加。其次，組織樣本在捕獲區(qū)（Visium HD）或成像區(qū)（Xenium）的排列方式多種多樣——一張載玻片可以容納一個(gè)大樣本、幾個(gè)中等樣本或多個(gè)小樣本（圖3）。考慮到這一差別，從運(yùn)行的玻片數(shù)量（而非嚴(yán)格意義上的分析樣本數(shù)）來(lái)考慮這些技術(shù)可能會(huì)有所幫助。
圖3. Visium HD和Xenium載玻片上的組織放置方式示例。Visium HD（上圖）或Xenium（下圖）的單次運(yùn)行可根據(jù)各種不同的組織配置來(lái)優(yōu)化，包括（但不限于）單塊大切片和組織芯片，具體取決于實(shí)驗(yàn)的需求。
作為一種基于NGS的技術(shù)，每次Visium HD運(yùn)行的輸出結(jié)果是一個(gè)測(cè)序文庫(kù)。這樣您就能在單次NGS運(yùn)行中批量處理大量樣本。因此，在Visium分析時(shí)，您能夠通過(guò)批量處理大量樣本的測(cè)序文庫(kù)來(lái)擴(kuò)大規(guī)模。Visium HD工作流程本身大約需要2-3天，其中手動(dòng)操作約8小時(shí)，并且可根據(jù)樣本、人員、熱循環(huán)儀和CytAssist儀器的可用性進(jìn)行并行處理。
Xenium是一種基于成像的技術(shù)，而單細(xì)胞空間成像實(shí)驗(yàn)中最耗時(shí)的部分就是成像。盡管我們已經(jīng)竭盡全力來(lái)優(yōu)化這些步驟，但每次Xenium運(yùn)行都需要自己的圖像采集和分析，這與基于NGS的Visium HD工作流程中的測(cè)序步驟最為相似。
對(duì)基于成像的Xenium來(lái)說(shuō)，組織分析時(shí)間和通量隨分析的組織總面積和分析多重性而定。在利用480重基因組合分析總面積為4 cm2 的組織（使用多模態(tài)細(xì)胞分割）時(shí)，我們預(yù)計(jì)手動(dòng)操作時(shí)間為6小時(shí)，圖像采集前的準(zhǔn)備時(shí)間為2-3天，這些操作可并行開(kāi)展，取決于樣本、人員和擴(kuò)增儀器的可用性。基于這些參數(shù)，圖像采集和分析可能需要長(zhǎng)達(dá)3天的時(shí)間，不過(guò)您可以選擇分析組織上的部分區(qū)域來(lái)縮短運(yùn)行時(shí)間。
Xenium原位分析和Visium HD分析的數(shù)據(jù)最終分別以基于成像和測(cè)序的形式輸出。兩個(gè)平臺(tái)都提供了直觀的數(shù)據(jù)可視化和分析流程，并與第三方工具輕松兼容，讓您能夠充分利用數(shù)據(jù)。
在Visium文庫(kù)測(cè)序完成后，通過(guò)Space Ranger分析流程運(yùn)行數(shù)據(jù)。這些輸出結(jié)果（包括但不限于特征條形碼矩陣（h5）和組織位置（parquet）等文件格式）可通過(guò)Loupe Browser進(jìn)行可視化，并對(duì)Visium聚類進(jìn)行差異分析和再聚類（圖4）。
圖4. Loupe Browser中的Visium HD數(shù)據(jù)可視化示例。可視化結(jié)果呈現(xiàn)了E17小鼠胚胎中轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)分布。
Xenium數(shù)據(jù)的機(jī)載分析與圖像采集和分析步驟同步進(jìn)行，因此在運(yùn)行結(jié)束后會(huì)立即生成可解釋的數(shù)據(jù)，具體格式包括ome.tiff（圖像）、.parquet、.zarr和.csv（轉(zhuǎn)錄本）。這些輸出結(jié)果可通過(guò)Xenium Explorer進(jìn)行可視化（圖5）。
圖5. Xenium Explorer中的Xenium數(shù)據(jù)可視化范例。可視化結(jié)果呈現(xiàn)了利用Xenium人類多種組織和癌癥基因組合分析的FFPE人類肺癌組織。
Xenium和Visium HD都特有全面整合且直觀的數(shù)據(jù)可視化和分析流程、多種開(kāi)放格式的文件輸出以及與第三方分析工具的輕松兼容。
如果您想了解visium HD 和Xenium，歡迎您聯(lián)系我們！
